Exosome 血液样本收集方法及注意事项    Blood  Samplecollection and processing
	关于临床血液样本实验设计和对照请参照：Exosome 临床样本研究实验设计和对照
	采血管的选择： 血浆（plasma）：紫盖采血管（EDTA-K2 或 EDTA-K3）         BD货号：367841-2ml  367862-4ml  367863-6ml  366643-10ml 等 血清（serum）：黄盖采血管（促凝管 或 促凝管带分离胶）      BD货号：366566-5ml  367985-10ml  等 血液样本需要记录和注意的包括以下部分：  采血时间Time sample obtained 采血针的类型/其他配件Needle type/other apparatus used 抗凝管的类型Anticoagulant(s) and tube types 起始弃去的血液有多少？止血带是否移除迅速？How many millilitres were discarded at initiation of Draw? Was tourniquet removed promptly? 采血时间和离心时间间隔有多久Time interval between draw and centrifugation 处理注意事项（样本是否保持垂直？是否室温存放？）Notes on handling (tube kept upright? room tem-perature?) 是否溶血和检测方法？Haemolysis and method of assessment 样本处理细节Sample processing details （转子类型Rotor type、离心力rcf、离心时间 time） 样本分装细节和存放Sample aliquot details and storage 细胞是否分离？Were cells obtained? Notes. 全血计数？Complete blood count? 流式检测？Flow cytometry panel (specify)? 是否还进行其他血液检测？Other assays performed on blood? 是否有匹配的其他样本收集（比如血浆和血清，尿液，鼻液，口水等）Were additional matched samples collected? (e.g.plasma and serum, urine, nasal secretions, saliva) 是否有病人亲属样本作为对照Were samples obtained from an accompanying friend or family member as a control (for patients)?
	参考文献：International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) 2013
	常见问题及回答
	1.血浆（plasma）还是血清(serum)？     对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究，我们推荐使用血浆（plasma）。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在30min内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆（或者血清）。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。
	2.怎样选择抗凝剂（anticoagulant）？     抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素（heparin）抗凝剂。无论是外源性或内源性起源（例如肥大细胞），肝素会抑制下游PCR反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。 对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内,在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾(NaF/KOx),或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶碱(theophylline)、腺苷(adenosine)和双嘧达莫(CTAD)]就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。
	3.静脉取血过程应该注意什么?     在血液处理过程中，由于物理作用力，血小板中的Exosome容易在处理过程中释放，这些外力包括，接触，压力，剪切力，所以标准化的样品处理，需要统一的注射器型号以及其他操作。使用21好针头或者更大号的针头可以避免静脉取血剪切力引起的不良效应。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。
	4.样本受昼夜节律，采血时间和饮食状态的影响吗？     血液学参数在人体的一天之中是有变化的。血液粘稠度的轻微变化在几十年前就已发现。最近发现，昼夜节律对于血小板的激活具有很大的影响，而且比压力（包括锻炼身体）的影响还要大。 白细胞穿梭以及在促炎症因子和抗炎症因子在血液循环中存在也在一天当中有变化。因此，对于Exosome的研究，在实验设计上，需要有严格的对照，采血时间在昼夜节律上的一致才能更容易的比较样本差异。 此外，还需要考虑，样本来源人体在正常睡眠/苏醒 周期上差异性。食物对于Exosome的影响目前还不知道，但是因为脂蛋白载着RNA，食物的吸收影响血液循环中脂蛋白颗粒的类型，数量和功能，一次采血可以在饭后一个统一的时间点进行。因此进食记录也是很有价值的。
	5.还需要额外的数据收集吗?     来自血液其他数据对于分析病理生理作用也是很有意义的。有时，可能还需要分离其它细胞如白细胞，或者血清游离DNA/RNA作为Exosome的对照。有时需要流式细胞术配合抗体对细胞分选或分析，确定血液细胞组分的比例。血中Exosome可能来自其他组织器官，有时需要从同一个患者身上得到多种体液与血液进行对比，例如脑脊液(CSF)和血浆样本。
	6.溶血是否影响结果？     一般溶血样本通过颜色就可以看出来，如果必要可通过分光光度计和血红蛋白释放试验测量。当分析总exRNA,溶血的血液制品含有高浓度的特定RNA,其中包括miR-16和-miR-451。还有待确定RNA以这种方式释放是否会干扰exRNA分析结果。