| Exosome（外泌体）提取常见问题回答 |
| 1. |
你们的试剂盒能分离比如更大的直径/纯化其他类型的囊泡吗，1000nm的胞外囊泡？ |
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不行，我们的试剂盒不能分离直径超过300nm 的囊泡。 |
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| 2. |
你们的试剂盒可用于血浆吗？ |
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可以，血液Exosome 提取试剂盒 适用于血清和血浆。 |
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| 3. |
使用你们的 血液Exosome 提取试剂盒可以处理的最小的血清样本是多少？ |
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最小的样本体积为50µL。我们建议使用100µL-500µL血清或血浆。 |
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| 4. |
可以用你们的试剂盒从体外培养细胞中分离exosome 或内皮微粒（endothelial microparticles）吗？ |
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我们的培养细胞Exosome 提取试剂盒可以从细胞培养基中分离exosome，不能从细胞中分离微粒。 |
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| 5. |
你们的试剂盒提取的外泌体是否会被IgG和/或珠子污染？ |
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我们的试剂盒不使用抗体或珠子分离。所以最后的外泌体不会被IgG或珠子污染。 |
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| 6. |
你们的试剂盒提取的exosome是否含有白蛋白albumin？ |
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某些类型的细胞例如肝细胞携带丰富的白蛋白，由肝脏产生的exosome（含有白蛋白）可以被释放进入体内循环系统。所以如果exosome是从某些细胞类型或者血清样本中分离的，也许会含有白蛋白。 |
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| 7. |
我的 D.discoideum变形虫能使用你们的培养细胞Exosome 提取试剂盒吗？ |
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培养细胞Exosome提取试剂盒可以从细胞上清中捕获释放的exosome。对于变形虫exosome分离，我们建议收集变形虫细胞培养基，再分离exosome。 |
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| 8. |
最后的分离的exosome所在的缓冲液成分是什么？它会影响我接下来的实验吗？ |
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最后分离的exosome是聚合的纳米微粒悬浮在PBS中（包含了少量的原始培养基或血清）。悬浮的缓冲液与大多数的下游实验相匹配，包括RNA/蛋白提取，TEM实验，表面标记等。 |
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| 9. |
我怎样检测分离后的exosome是纯的，而没有其他的类型的囊泡microparticles(shredding vesicles)？ |
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可以使用电镜分析。使用我们的试剂盒从细胞培养基中或血清中分离的微泡为球型膜结构，在电镜扫描下直径在20-200nm之间。这些特性帮助判定收获的微泡是exosome。shredding vesicles是不规则的形状，并且直径可达1000nm。我们分离的微泡的在100~200nm之间。 |
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| 10. |
你们试剂盒分离的exosome是否具有功能活性？ |
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我们试剂盒提取的exosome包裹的miRNA具有功能活性。exosome中的miRNA能激活靶细胞内靶点mRNA。 |
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| 11. |
培养细胞Exosome 提取试剂盒和尿液Exosome 提取试剂盒必须使用玻璃管吗?我在哪里可以找到玻璃管? |
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在步骤3和步骤4必须使用玻璃管来代替塑料管。 请在Fisher Scientific买玻璃管，http://www.fishersci.com(寻找Fisherbrand* Disposable Borosilicate Glass Tubes Cat. NO: 14-961-26)。 |
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| 12. |
培养细胞Exosome 提取试剂盒和尿液Exosome 提取试剂盒怎么看不到浑浊的中间层？ |
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下列处理错误可能会导致失败：1). 在加入细胞培养基和血清前溶液A/B/C没有混合完全。2). 没有低速离心去除细胞和细胞碎片。3). 比例不对。例如： 0.125 mL A + 0.125 mL B + 0.5mL C到2ml培养基。血清/培养基体积对溶液混合剂（A/B/C）的比例过大将导致界面分离不清。4). 最大的起始体积为4ml培养基，它应该来自于100万培养细胞的一半或更少。 如果细胞数或培养基体积超过这个数量，则样品应该分成几份进行提取。5). 培养的细胞没有血清饥饿48h来去除FBS中（培养细胞血清中）的exosome。 |
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| 13. |
你使用什么生物标志物来鉴别分离的外泌体？ |
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我们使用exosome marker，例如： flotillin，CD9, CD63, CD81, Alix, 和 TSG101 等来鉴定分离的exosome。 |
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| 14. |
对于exosome RNA RT-PCR实验你们推荐什么内参？ |
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这取决于具体样品。而且你决定使用什么参照取决于你的具体实验班。可以选择外源添加cel-miR-39-3p，或内源U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72作为内参。 |
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| 15. |
使用你们的试剂盒提取的exosome得率是多少? |
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| 产品 |
样品 |
建议样本量 |
预计产量 |
外泌体
（在PBS中） |
外秘体蛋白 |
外秘体RNA |
培养细胞Exosome 提取试剂盒
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细胞培养基 |
2-4mL |
50-200µL |
150-400µg |
50-200ng |
培养干细胞Exosome 提取试剂盒
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细胞培养基 |
20ml |
50-200µL |
100-1000µg |
50-300ng |
血液Exosome 提取试剂盒
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血清 |
200µL |
100-200µL |
300-400µg |
200-300ng |
尿液Exosome 提取试剂盒
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尿液 |
3ml |
50-200µL |
150-400µg |
50-200ng |
体液Exosome 提取试剂盒
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体液 |
0.1-1ml |
根据样品 |
根据样品 |
根据样品 |
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| 16. |
如果我需要从血浆中分离外泌体，我可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗？ |
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不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂，用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。 |
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采血管的选择：
血浆（plasma）：紫盖采血管（EDTA-K2 或 EDTA-K3）BD货号：367841-2ml 367862-4ml 367863-6ml 366643-10ml 等
血清（serum）：黄盖采血管（促凝管 或 促凝管带分离胶）BD货号：366566-5ml 367985-10ml 等 |
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| 17. |
培养细胞时，血清来源的Exosome(外泌体)怎么去除？ |
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多数情况，细胞在体外培养需要血清，但人血清或胎牛血清（FCS）中含有exosome和RNA。为了避免血清污染细胞产生的exosome，一般采用2种方法：
1.细胞培养前，通过100000g超速离心过夜，去除血清exosome。但由于血清具有粘度，离心会导致血清被稀释多致20%。离心后是否彻底去除血清exosome，可以通过Western Blot 检测转铁蛋白受体（transferrin receptor）或flottilin-1。
2.更多的实验室会选择无血清培养（serum-free medium）。有些细胞，例如原代神经元的培养，可在无血清培养基中添加生长因子。很多需要血清生长的细胞（例如肿瘤细胞株），可以在没有血清的情况下生存几天，因此在收获exosome时，只需更换无血清培养基培养48小时即可。 |
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| 18. |
细胞培养过程中的死细胞是否会影响exosome（外泌体）的分析？ |
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会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，细胞最终会裂成碎片，它们在exosome的纯化过程中会污染活细胞产生的exosome。 |
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| 19. |
样品在exosome （外泌体）提取前是否可以冻存？ |
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可以。血样、尿样、体液等，需要攒齐了一起提取，或者同一个患者的样本多次提取。冻存前，首先要离心去除细胞和血小板，再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。 |
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| 20. |
exosome（外泌体）提取后是否可以冻存？ |
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可以。使用硅化E.P.管或冻存管，减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融，但我们仍建议分装，避免多次反复冻融。对于一些功能性实验，建议不要冻存，直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。 |
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