Western Blot 常见问题分析 Q: 为什么实际条带大小与预测的不同？

A: 通常来说蛋白质印迹法(Western BLot)是一种根据蛋白质大小而分离蛋白质的方法，越小的蛋白质在凝胶中迁移的越快。但是，迁移还受其他因素影响，所以观察到的实际条带的大小也许会与预测的不同。常见的因素包括： 翻译后的修饰—例如磷酸化，糖基化等，这增加了蛋白质的大小。 翻译后的断裂—例如许多蛋白质被合成为前体蛋白，然后裂解得到活化型，例如半胱天冬酶,OPN。   剪切异构体—选择性剪接可能从同一个基因产生不同大小的蛋白。相对电荷—氨基酸组成（带电的和不带电的） 多聚体—例如二聚化的蛋白质。通常是避免在还原条件下，虽然强的相互作用可导致较高分子量的条带外观。

Q: 一抗最好是在4°C 孵育过夜？

A: 4°C 孵育过夜通常使染色更高效和特异性。然而，许多抗体在室温下孵育1或2小时也有很好的效果。

Q: 怎样优化抗体浓度?

A: 首先，要查看说明书中参考起始浓度。然后根据预实验结果调整，有背景，降低抗体浓度，如果无信号，增加抗体的浓度。

Q: Western Blot需要的样品量是多少？

A: 一般如果是细胞裂解液，膜和核裂解产物：每孔加样量为20～30μg总蛋白。 纯化的蛋白（重组的或内源的）：加10～100ng的蛋白质。另外还要根据蛋白的表达情况，高表达的蛋白降低加样量。低表达的蛋白增加加样量。

Q: 封闭液对结果有影响吗?

抗体对封闭液敏感，我们建议查看说明，看看是否有任何资料显示该抗体使用哪种封闭液更好，不论是BSA还是脱脂奶粉。通常，BSA的结果更清晰因为它含有更少的可以与抗体交叉反应的蛋白质。但也不一定，有些抗体使用脱脂奶粉封闭更好，因为它含有更多种类的阻断蛋白。

Q: 用蛋白Marker检查曝光结果发现条带大小不对？

记住，蛋白质通过凝胶迁移可被很多其他因素影响，所以观察到的实际条带大小也许会与预测的不同。一般的影响因素包括：翻译后修饰，翻译后断裂，剪接变异体和亚型，相对电荷，多聚体。   Q: 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？ A:如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。   Q:蛋白变性后可以存放多久？ A:－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。   Q:一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？ A:Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。   Q:Western Blot 中抗体的重复应用问题 A:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。       Q:在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ A:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。     Q:细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？ A:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。   Q:怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直? A:影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶   Q:没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做western blot吗？ A:不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏   Q:做Western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？ A:最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。    Q:Western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？ A:PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。   Q:Western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？用于Western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？ A:作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带     Q:结合ECL之后显影发现胶片上的条带是空心的，而且荧光很快就没了？ A:一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉，导致蛋白丰度越高的地方反而没带，边缘地带反而有显色   Q:条带呈笑脸状︶ A:凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。   Q:条带呈皱眉状︵ A:可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。   Q:Western blot结果中杂带较多 A: 1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。 2.目的蛋白有其它剪切本 3.样本处理过程中目的蛋白发生降解，可以加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 4.上样量过高，太敏感，可适当减少上样量。 5.一抗特异性不高，可重新选择或制备高特异性的抗体。 6.一抗或者二抗浓度偏高，可适当降低抗体浓度。   Q: Western blot结果中无信号或显示信号弱 A:  1.检测样本不表达目的蛋白，可选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 2.检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 3.转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。 4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。 5.一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜。 洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。   Q:膜上多处出现黑点或黑斑 A:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。   Q:反白（条带显白色） A:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。