Q:细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?
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A:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。
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Q:怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道和band都能很直?
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A:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶
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Q:没有注明可以用来做Western blot的一抗,可以用来做western blot吗?
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A:不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的,识别构象型表位的抗体不能用于western blotting,因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原,而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏
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Q:做Western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗的吗?
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A:最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话,就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。
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Q:Western blot 使用的膜哪种最好啊,PVDF好还是NC膜,如何选择?
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A:PVDF膜价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。
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Q:Western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些?用于Western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求?
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A:作为western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带
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Q:结合ECL之后显影发现胶片上的条带是空心的,而且荧光很快就没了?
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A:一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉,导致蛋白丰度越高的地方反而没带,边缘地带反而有显色
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Q:条带呈笑脸状︶
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A:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。
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Q:条带呈皱眉状︵
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A:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。
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Q:Western blot结果中杂带较多
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A: 1.目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。
2.目的蛋白有其它剪切本
3.样本处理过程中目的蛋白发生降解,可以加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。
4.上样量过高,太敏感,可适当减少上样量。
5.一抗特异性不高,可重新选择或制备高特异性的抗体。
6.一抗或者二抗浓度偏高,可适当降低抗体浓度。
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Q: Western blot结果中无信号或显示信号弱
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A: 1.检测样本不表达目的蛋白,可选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白,提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白,购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5.一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜。
洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
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Q:膜上多处出现黑点或黑斑
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A:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
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Q:反白(条带显白色)
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A:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
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